Dependencia de la concentración de ligando

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El estudio cuantitativo de la dependencia de la formación del complejo proteína-ligando respecto de la concentración de reactantes se desarrollará para el caso particular en el que se cumplen las siguientes condiciones:

La formación del complejo entre una proteína P y un ligando L se puede representar por la siguiente ecuación:

#1 Siendo K1 la constante cinética de la asociación. Sus dimensiones son molar-1.s-1

Dado que la formación del complejo PL es un proceso reversible, este complejo se disociará según:

#2 Siendo K-1 la constante de velocidad de la reacción de disociación de P.L. Su dimensión es inverso de tiempo (s-1)  

Si en el medio se encuentran inicialmente P y L libres, al cabo de un tiempo se habrá establecido un equilibrio entre la proteína y el ligando libres y el complejo proteína ligando. Si consideramos la disociación del complejo, el equilibrio se ajustará a:

#3   Kd es la denominada Constante de Disociación, y corresponde a la constante de equilibrio de la disociación del complejo P.L. No confundir con K-1, que es la constante de velocidad para la reacción de disociación. Kd tiene unidades de concentración
     
#4  

Se trata de conocer la concentración del complejo P.L en función de las concentraciones de proteína total y de ligando total que tenemos en el medio. Si la concentración de ligando unido a la proteína es despreciable frente a la concentración de ligando libre, en el equilibrio se cumple que:

#5 Se puede deducir fácilmente esta ecuación. Considere que en el equilibrio las velocidades de formación y de disociación del complejo P.L son iguales, y que la concentración de proteína libre es igual a la concentración total de proteína menos la concentración del complejo P.L

En muchas ocasiones lo que interesa conocer es la proporción de moléculas de proteína que tienen unido el ligando, en vez de su concentración absoluta. Para ello definimos la fracción de saturación Y:

Evidentemente, Y varía entre 0 (ninguna molécula de proteína tiene ligando unido) a 1 (todas las moléculas de proteína están unidas al ligando). En el caso de que la proteína tenga más de un sitio de unión para el ligando la fracción de saturación se definiría de igual manera, pero ahora habría que multiplicar [P]total por el número de sitios totales por molécula de proteína, y la [P.L] por el número medio de sitios ocupados en el complejo. Poniendo ahora la ecuación #5 en función de Y tenemos:

#6

Esta ecuación corresponde a una hipérbola equilátera; la rama horizontal tiende asintóticamente al valor 1 de la fracción de saturación; desde un punto de vista estrictamente matemático, nunca se alcanza la saturación total. Un aspecto importante es que el valor numérico de Kd corresponde a la concentración de ligando que hace que la fracción de saturación valga exactamente 0,5. En esta TABLA se encuentran algunos valores de Kd representativos.

El valor de Kd, para una proteína y ligando concretos, depende críticamente de las condiciones experimentales: pH, fuerza iónica, temperatura o presencia de otros solutos en el medio. Esto es lógico si recordamos que todos los factores anteriormente señalados influyen sobre la estructura tridimensional de las proteínas, y que el sitio de unión es una zona concreta con una estructura definida dentro de la molécula de proteína.

Representación gráfica de la unión

En los siguientes ejemplos se han usado unidades arbitrarias para las concentraciones de ligando y para Kd. Puede considerar que estas unidades pueden ser mM, µM o nM, que son valores razonables. 

Gráfico 1

Curvas de saturación de cuatro ligandos cuyas Kd para una proteína hipotética tienen los valores de 1, 10, 50 y 200 unidades de concentración

 

 

En los cuatro casos, cuando la concentración del ligando iguala al valor de Kd, la fracción de saturación vale 0,5.

 

Note que la diferente forma de las curvas es un efecto de escala; las cuatro  curvas son similares.

 

Cuando se desea representar un rango amplio de concentraciones de ligando en la misma gráfica se usa un eje logarítmico para las concentraciones.

 En este caso se puede ver fácilmente que las cuatro curvas son idénticas, estando simplemente desplazadas respecto las concentraciones de ligando.

ATENCIÓN:

No confundir con las curvas sigmoideas que ocurren cuando la unión proteína-ligando presenta saturación homotrópica positiva.

En esta figura la saturación sigue siendo hiperbólica, aunque al representar los datos de concentración se ha empleado una escala logarítmica lo que hace que la forma de las curvas cambie.

Antes del empleo común de ordenadores y de los programas de ajuste de datos a funciones no lineales la determinación de Kd debía hacerse previa linearización de la ecuación de saturación. Existen varias posibilidades, pero una de las más empleadas ha sido la denominada representación de Scatchard.

Cuanto menor sea Kd menor es la concentración de ligando necesaria para saturar la proteína, y mayor es la afinidad de la proteína hacia el ligando. Podemos definir la afinidad de una enzima hacia un ligando como un parámetro semicuantitativo relacionado con la inversa de la constante de disociación. Semicuantitativo porque se dice "mucha" o "poca afinidad", o "la afinidad de la proteína A hacia L es mayor que la de B". Esta última afirmación es análoga a decir que la Kd del complejo A.L es menor que la Kd del complejo B.L.

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